科研丨武大＆武大人民医院: 肠道微生物表达的3β

导读   睾酮缺乏会导致人类出现抑郁症状；然而，造成这一缺陷的原因尚不完全清楚。在本研究中，我们从睾酮缺乏的抑郁症患者的粪便样本中分离出Mycobacterium neoaurum，并表明该菌株可以在体外降解睾酮。此外，用M. neoaurum灌胃大鼠会降低其血清和脑睾酮水平，并诱导抑郁样行为。我们鉴定了编码3β-羟类固醇脱氢酶(3β-HSD)的基因是导致睾酮降解的酶，将3β-HSD引入大肠杆菌可增强其降解睾酮的能力。用产生3β-HSD的大肠杆菌灌胃大鼠会降低其血清和脑睾酮水平并引起抑郁样行为。最后，与无抑郁症参与者的16.67%相比，抑郁症患者的粪便样本中有42.99%（46/107）含有3β-HSD，这些粪便样本中有60.87%（28/46）表达3β-HSD。这些结果表明，肠道微生物表达的3β-HSD可能与睾酮降解引起的抑郁症状有关。     图文摘要    论文ID原名：3β-Hydroxysteroid dehydrogenase expressed by gut microbes degrades testosterone and is linked to depression in males译名：肠道微生物表达的3β-羟类固醇脱氢酶可降解睾酮，并与男性抑郁症有关期刊：Cell Host & MicrobeIF：31.316发表时间：2022.2通讯作者：刘忠纯，王高华，李艳，刘天罡通讯作者单位：武汉大学人民医院；武汉大学药学院DOI号：10.1016/j.chom.2022.01.001 实验设计结果1 患有和不患有抑郁症的参与者的 睾酮缺乏症 为探讨抑郁症患者睾酮缺乏症的发生率，将符合《精神疾病诊断与统计手册》（DSM-V）中重度抑郁症（MDD）或心境恶劣障碍诊断标准的精神科患者纳入抑郁症组（n=77）。不符合MDD或心境恶劣障碍DSM-V诊断标准的健康参与者被纳入非抑郁组（n=102）。采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）对两组血清睾酮水平进行定量。非抑郁组的平均血清睾酮水平（549.24±269.16 ng/dL）显著高于抑郁组（312.97±173.18 ng/dL；p<0.001；图S1A）。根据欧洲泌尿外科协会、欧洲男科学会和国际男科学会的数据，用于诊断睾酮缺乏症的睾酮阈值低于350 ng/dL。抑郁组和非抑郁组睾酮缺乏的发生率分别为54.55%（42/77）和11.76%（12/102）。抗抑郁药会影响血清睾酮水平，因为氟西汀、文拉法辛和氯胺酮会降低男性治疗后的睾酮水平，而阿米替林和丙咪嗪可以增加睾酮水平。因此，我们从抑郁症组中排除了47名使用抗抑郁药的患者，发现未经治疗的抑郁症患者睾酮缺乏的发生率为30.00%（9/30）。 2 抑郁症患者粪便移植诱导大鼠抑郁样行为 为了研究抑郁症患者的肠道菌群是否可以降解睾酮，我们用睾酮（2 g/L）培养肠道菌群。薄层色谱（TLC）分析表明，在83%（5/6）的抑郁症患者中，粪便可以将睾酮降解为雄烯二酮（AD），在67%（4/6）的抑郁症患者中，粪便可以进一步降解AD。来自非抑郁组的所有（6/6）粪便样本均未显示出明显的睾酮降解（图S2）。 此外，为了确定抑郁症患者的肠道菌群是否会降低睾酮水平并导致抑郁样行为，我们通过管饲法进行了粪便移植。将大鼠分为以下3组：（1）对照组，灌胃生理盐水1 mL，每日1次，连续3天；(2)非抑郁菌群，移植非抑郁参与者的肠道菌群1 mL，每天一次，连续3天；(3)抑郁症菌群组，移植抑郁症患者的肠道菌群1 mL，每天一次，连续3天（图1A）。 由于所有大鼠在其饮用水中用抗生素混合物(ABX)处理1周以在灌胃前消耗肠道微生物群，这可能会影响血清睾酮水平，我们检测了未处理大鼠和ABX处理大鼠之间的血清睾酮水平。治疗4周后，两组之间没有明显差异（图S1B），这进一步表明ABX治疗对这种情况下的血清睾酮水平没有影响。然后，我们用参与者的肠道微生物群对ABX治疗的大鼠灌胃；使用LC-MS/MS对血清睾酮的定量显示，抑郁症菌群组的血清睾酮水平显著低于对照组（118±31 ng/dL vs 232±90 ng/dL；p=0.018；图1B）和非抑郁菌群组（118±31 ng/dL vs 225±75 ng/dL；p=0.033；图1B）。接下来，我们使用LC-MS/MS对脑睾酮水平进行了量化，结果显示抑郁症菌群组的脑睾酮水平在统计学上显著低于对照组（5.04±2.37 ng/g vs 12.61±3.78 ng/g；p=0.042；图1C）和非抑郁微生物群组（5.04±2.37 ng/g vs 14.39±7.16 ng/g；p=0.012；图1C）。行为实验表明，在悬尾试验（TST）和强迫游泳试验（FST）中，抑郁菌群组大鼠的不动时间长于对照组和非抑郁菌群组大鼠，在新奇抑制摄食(NSF)和飞溅试验中，抑郁菌群组大鼠的潜伏时间比对照组和非抑郁菌群组大鼠长（图1D和S3A-S3C）。这些结果表明，抑郁症患者的微生物群可以降低血清和脑睾酮水平，并诱导大鼠出现抑郁样行为。图1. 接受抑郁症患者粪便移植的大鼠表现出抑郁样行为。(A)对照大鼠、非抑郁菌群受体大鼠和抑郁菌群受体大鼠的实验时间表。所有大鼠（7周龄）在灌胃前抗生素处理7天，然后高压灭菌水处理1天。对照大鼠每天一次用盐水（1 mL）灌胃，连续3天。非抑郁微生物组大鼠每天一次用来自非抑郁参与者的1 mL肠道微生物群进行灌胃，连续3天。抑郁症微生物群组大鼠每天一次用来自抑郁症患者的1 mL肠道微生物群灌胃，连续3天。(B)使用靶向LC-MS/MS测定对照大鼠(n=6)、非抑郁症菌群受体大鼠(n=6)和抑郁症菌群受体大鼠(n=6)血清中的睾酮浓度。(C)使用靶向LC-MS/MS测定对照大鼠(n=6)、非抑郁菌群受体大鼠(n=6)和抑郁菌群受体大鼠(n=6)大脑中的睾酮浓度。(D)三组大鼠在FST中静止不动的时间、在TST中静止不动的时间、在飞溅试验中梳理毛发的潜伏期和在NSF中进食的潜伏期。数据表示为平均值±标准误差(±SEM)，并使用Tukey多重比较检验进行单因素方差分析以计算统计显著性(* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001)。3 从睾酮缺乏的抑郁症患者中分离睾酮降解菌 因为肠道微生物对睾酮的降解会降低血清睾酮，所以我们使用睾酮作为唯一的碳源来培养一名未经治疗的抑郁症患者的粪便；我们分离了几种细菌，但只有一种可以降解睾酮（图2A）。然后，我们对其进行了测序分析鉴定。在系统发育树中，该菌株的16S rRNA序列与Mycobacterium neoaurum的相似度为99.0%~99.8%，与其他分枝杆菌的相似度为98.6%~99.7%。我们将此菌株命名为M. neoaurum MN2019。尽管使用睾酮作为唯一碳源分离出M. neoaurum，但该菌株也可以在具有一般碳源的培养基中生长，例如在Luria-Bertani(LB)或血琼脂平板中。药敏试验表明M. neoaurumMN2019对红霉素和阿米卡星敏感； M. neoaurum中红霉素的最低抑菌浓度（MIC）为0.25 mg/L，M. neoaurum中阿米卡星的MIC为0.75 mg/L（图S4A）。M. neoaurum最初于1972年从土壤中分离出来，并且在临床感染中也被发现，例如血流感染、人工瓣膜心内膜炎、血管导管感染和肺部感染。尽管M. neoaurum可以转化几种甾醇，但其降解睾酮的能力尚未见报道。根据之前的研究，我们使用发酵培养基进行甾醇降解，并添加睾酮（2 g/L）作为辅助生长的碳源，以验证M. neoaurum的降解能力。TLC结果显示，与标准相比，睾酮水平逐渐下降，而主要产物AD的水平逐渐上升（图S4B）。高效液相色谱（HPLC）定量分析显示睾酮水平下降。培养96 h后，睾酮水平下降91.78%。代谢物包括AD、androsta-1,4-diene-3,17-dione(ADD)和9α-hydroxyandrosta-1,4-diene-3,17-dione（图2B和2C）。主要代谢物是AD，占所有代谢物的91.85%（图2C）。这些结果表明睾酮可以被M. neoaurum降解。图2. 睾酮降解菌的分离和验证。(A) M. neoaurum典型菌落的图像。(B)M. neoaurum降解睾酮的时间过程。数据点表示平均睾酮水平±标准差（3个生物学重复）。(C)联合EICs显示M. neoaurum对睾酮的时间依赖性降解。菌株在2 g/L睾酮下生长，并使用HPLC分析来自指定时间点的等分试样。(D)睾酮降解途径。4 灌胃M. neoaurum诱导大鼠抑郁样行为 为了探索肠道中的M. neoaurum是否会导致抑郁样行为，我们通过管饲法对大鼠施用M. neoaurum。将大鼠分为以下3组：（1）对照组，灌胃生理盐水1 mL，每日1次，连续3天；(2)M. neoaurum受体组，给予M. neoaurum（约1×108菌落形成单位[cfu]，每天一次，连续3天）；(3)红霉素治疗组，口服M. neoaurum后给予红霉素10 mg/kg，每日1次，连续7天(图3A)。 使用LC-MS/MS对血清睾酮水平进行定量分析，结果显示M. neoaurum受体大鼠的血清睾酮水平显著低于对照组（93±75 ng/dL vs 243±104 ng/dL；p=0.002；图3B)。接下来，我们使用LC-MS/MS对脑睾酮水平进行了量化，结果表明M. neoaurum受体大鼠的脑睾酮水平在统计学上显著低于对照组（4.56±3.07 ng/g vs 12.41±4.67 ng/g；p<0.001；图3C)。 行为实验表明，在TST和FST中，M. neoaurum受体大鼠的不动时间比对照大鼠长，而在NSF和飞溅试验中，M. neoaurum受体大鼠的潜伏时间为比对照大鼠长（图3D和S3D-S3F）。为了评估经口管饲后M. neoaurum的存活率，我们在行为测试后培养了M. neoaurum受体大鼠的粪便，分离出看起来像M. neoaurum的菌落，并使用16S rRNA测序进一步鉴定以进行确认。然而，未从对照大鼠的粪便中分离出M. neoaurum。接下来，我们还对从M. neoaurum受体大鼠的粪便中提取的总RNA进行了qRT-PCR。我们选择了M. neoaurum的特异性标记基因（数据S1）来设计M. neoaurum的特异性引物，并显示基因转录物位于M. neoaurum受体大鼠（n=12）的肠道中，而不是位于对照大鼠（n=12）的肠道中（图S5A和S5B）。这些结果表明，从管饲到行为试验，M. neoaurum在M. neoaurum受体大鼠的肠道中存活。 为了确定抗生素治疗是否可以缓解M. neoaurum受体的血清睾酮缺乏和抑郁样行为，我们通过管饲法给药红霉素1周（每天10 mg/kg）（图3A）。红霉素灌胃两周后，LC-MS/MS分析显示，接受红霉素治疗的M. neoaurum受体血清睾酮水平(238±115 ng/dL)恢复到对照组的水平(243±104)ng/dL；p=0.994；图3B)。我们还使用LC-MS/MS对脑睾酮水平进行了量化，结果表明用红霉素(11.45±4.78 ng/g)治疗的M. neoaurum受体的脑睾酮水平恢复到对照组的水平（12.41±4.67ng/g；p=0.844；图3C)。 在行为实验中，红霉素处理的M. neoaurum大鼠和对照大鼠的FST和TST中的不动时间以及NSF和飞溅试验中的潜伏时间相似。这些结果表明，红霉素治疗后M. neoaurum受体的抑郁样行为得到缓解（图3D和S3D-S3F）。为了确定红霉素处理是否影响M. neoaurum的存活，我们在行为试验后培养了红霉素处理的M. neoaurum大鼠的粪便，没有分离出M. neoaurum。接下来，我们对从红霉素处理的M. neoaurum大鼠的粪便中提取的总RNA含量进行了qRT-PCR，结果表明该基因在红霉素处理的M. neoaurum大鼠的肠道中没有转录(n=12)（图S5C）。这些结果表明红霉素对M. neoaurum有杀灭作用。这些数据表明，M. neoaurum灌胃降低了大鼠的血清和脑睾酮水平并诱导了抑郁样行为。此外，补充红霉素可使睾酮水平和行为正常化。图3. M. neoaurum受体大鼠表现出抑郁样行为。(A)对照大鼠、M. neoaurum受体大鼠和M. neoaurum受体大鼠用红霉素治疗的实验时间表。所有大鼠（7周龄）在灌胃前用抗生素处理7天，然后用高压灭菌水处理1天。对照大鼠用盐水（1 mL）灌胃，每天一次，连续3天。M. neoaurum受体大鼠用M. neoaurum（约1×108 cfu）灌胃，每天一次，连续3天。用红霉素（M. neoaurum+红霉素）治疗的M. neoaurum受体大鼠每天一次用M. neoaurum（约1×108 cfu）灌胃，连续3天；然后，在大鼠10周龄时开始红霉素治疗（10 mg/kg灌胃），持续1周。灌胃第一天后四周，在一周内对大鼠进行行为观察，然后进行睾酮水平测量和细菌检测。 (B)使用靶向LC-MS/MS方法测定各组大鼠血清睾酮浓度。(C) 使用靶向LC-MS/MS方法测定各组大鼠的脑睾酮浓度。(D) 各组大鼠在FST中静止不动的时间、在TST中静止不动的时间、在飞溅试验中梳理毛发的潜伏期和在NSF中进食的潜伏期。数据表示为平均值±SEM，并使用Tukey多重比较检验进行单因素方差分析以计算统计显著性(* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001)。5 鉴定M. neoaurum中介导睾酮降解的关键酶 我们推断M. neoaurum灌胃对抑郁样行为的影响可归因于其降解睾酮的能力。因此，我们假设通过引入睾酮降解酶基因构建睾酮降解菌株可以在大鼠通过灌胃给药后诱导抑郁样行为。为了构建重组大肠杆菌，我们试图在M. neoaurum中找到一种睾酮降解酶的基因序列。 使用来自京都基因和基因组百科全书数据库(KEGG)的BLAST处理有关类固醇降解的信息。遗憾的是，尚未在M. neoaurum VKM Ac-1815D中鉴定出睾酮降解酶3β/17β-羟类固醇脱氢酶(EC 1.1.1.51)。因此，我们接下来对M. neoaurum MN2019的基因组进行了测序。在M. neoaurum MN2019染色体（核碱基中66.26%的GC含量，登录号：CP074376）中，通过注释鉴定了编码3β-羟类固醇脱氢酶（3β-HSD）的基因MN2019_09885（图4A；数据S2）。为了构建睾酮降解菌株，将含有MN2019_09885基因的pET28a转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，获得大肠杆菌BL21(DE3)/pDL01（图S6A）。将载体pET28a引入大肠杆菌BL21(DE3)以构建大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a作为对照（图S6B）。使用PCR，我们验证了MN2019_09885基因在大肠杆菌BL21(DE3)/pDL01中发现，但在大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a中没有发现（图S6C）。 随后，我们在LB培养基中将大肠杆菌BL21(DE3)/pDL01或大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a与睾酮(2 g/L)一起培养。TLC分析表明，与标准相比，大肠杆菌BL21(DE3)/pDL01以时间依赖性方式将睾酮转化为AD（图S6D）。相反，睾酮没有被大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a转化（图S6E）。使用LC-MS/MS鉴定代谢物，证实大肠杆菌BL21(DE3)/pDL01降解睾酮的产物是AD（图4B）。使用HPLC量化睾酮和AD水平，大肠杆菌BL21(DE3)/pDL01可在24小时内将71.20%的睾酮转化为AD，在48小时内将89.41%的睾酮转化为AD（图4C）。为了探索由MN2019_09885基因编码的3β-HSD蛋白的活性，我们在大肠杆菌BL21(DE3)中过表达带有His-Tag的3β-HSD，并使用Ni-NTA柱纯化酶。测定了睾酮羟类固醇脱氢酶反应的纯化酶（图S6F）动力学常数kcat和KM（图4D）。酶3β-HSD有效催化睾酮的β-羟基脱氢，对于3β氧化，kcat、KM和kcat/KM值分别为0.222±0.017 min-1、101.9±25.46 μM和0.002 min-1μM-1。在之前的研究中，来自Comamonas testosteroni的17β-HSD的kcat、KM和kcat/KM值分别为0.0012±0.0002 min-1、11.8±2.0 μM和0.0001 min-1μM-1，表明M. neoaurum中的3β-HSD具有较高的睾酮降解活性。这些数据表明，M. neoaurum中的MN2019_09885基因将在大肠杆菌中表达3β-HSD。图4. 3β-脱氢途径的体外评估。(A)M. neoaurum MN2019染色体上用于睾酮降解的3β-HSD的结构和分布。 (B)联合EICs显示含有3β-HSD的大肠杆菌BL21(DE3)/pDL01与含有载体质粒pET28a的大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a的对照菌株将睾酮转化为AD。菌株用2 g/L睾酮培养96小时，用乙酸乙酯萃取，并使用LC-MS分析。实验独立重复3次。(C)联合EICs显示工程大肠杆菌将睾酮转化为AD的时间依赖性。菌株在2 g/L睾酮下生长，并使用HPLC对来自指定时间点的等分试样进行量化。该实验独立地重复了两次，并显示出相似的结果。(D)3β-HSD催化的睾酮减少的非线性回归。反应混合物在37°C下含有200 μM NAD+、25 mM Tris-HCl(pH 7.6)、5μM 3β-HSD和睾酮。酶动力学常数kcat=0.222±0.017 min-1和KM=101.9±25.46 μM。数据点表示平均水平±SEM。(E)睾酮3β-脱氢生成AD的建议途径。6 施用大肠杆菌BL21(DE3)/pDL01诱导大鼠抑郁样行为 接下来评估了通过灌胃给药大肠杆菌BL21(DE3)/pDL01的大鼠是否经历了抑郁样行为。将大鼠分为3组：（1）对照组，灌胃生理盐水1 mL，每日1次，连续3天；(2)大肠杆菌BL21(DE3)/pDL01-受体组，通过管饲法施用大肠杆菌BL21(DE3)/pDL01(约1×108 cfu，每天一次，连续3天)；(3)大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a受体组，通过管饲法施用大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a（约1×108 cfu，每天一次，连续3天；图5A）。 使用LC-MS/MS对血清睾酮水平进行量化，结果表明大肠杆菌BL21(DE3)/pDL01受体的血清睾酮水平显著低于对照组（94±60 ng/dL vs 246±134 ng/dL；p=0.007），与对照大鼠相比，大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a受体的血清睾酮水平未观察到显著变化（221±93 ng/dL vs 246±134 ng/dL；p=0.975；图5B)。接下来，我们使用LC-MS/MS对脑睾酮水平进行了量化，结果表明大肠杆菌BL21(DE3)/pDL01受体的脑睾酮水平显著低于对照组(5.04±2.28 ng/g vs 14.03±5.01 ng/g；p<0.001；图5C)和大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a受体（5.04±2.28 ng/g vs 14.27±4.91 ng/g；p<0.001；图5C）。 行为实验表明，在FST和TST中，大肠杆菌BL21（DE3）/pDL01受体的不动时间长于大肠杆菌BL21（DE3）/pET28a受体和对照大鼠。在NSF和飞溅测试中，大肠杆菌BL21(DE3)/pDL01受体的潜伏时间比大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a受体和对照大鼠的潜伏时间长（图5D和S3G-S3I）。与对照大鼠相比，在大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a受体中未观察到明显的抑郁样行为（图5D和S3G-S3I）。接下来，为了验证在实验过程中是否表达了3β-HSD，我们在行为分析后使用从粪便样本中获得的蛋白质进行了蛋白质印迹。在灌胃大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a受体的样本中未观察到明显条带，而在大肠杆菌BL21(DE3)/pDL01受体的样本中观察到条带（图S6G和S6H），表明大肠杆菌BL21（DE3）/pDL01受体在实验过程中表达3β-HSD。综上，这些结果表明，3β-HSD在肠道中的表达可以降低血清和脑睾酮，从而诱导大鼠出现抑郁样行为。图5. 灌胃给药大肠杆菌BL21(DE3)/pDL01在大鼠中诱导抑郁样行为。(A)对照大鼠、大肠杆菌BL21(DE3)/pDL01受体、大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a受体、用睾酮治疗的大肠杆菌BL21(DE3)/pDL01受体和AD-处理大鼠。灌胃第一天后4周，在一周内对大鼠进行行为观察，随后进行睾酮水平测定和3β-HSD检测。(B) 使用LC-MS/MS检测各组大鼠的血清睾酮浓度。(C) 使用LC-MS/MS检测各组大鼠的脑睾酮浓度。(D)各组大鼠在FST中静止不动的时间、在TST中静止不动的时间、在飞溅试验中梳理毛发的潜伏期和在NSF中进食的潜伏期。数据表示为平均值±SEM，并使用Tukey多重比较检验进行单因素方差分析以计算统计显著性((* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001)。7 补充睾酮可减轻大肠杆菌BL21(DE3)/pDL01受体的抑郁样行为 为了进一步评估睾酮缺乏在大肠杆菌BL21(DE3)/pDL01受体抑郁样行为中的作用，我们确定睾酮补充剂是否可以缓解这些表型。大肠杆菌BL21(DE3)/pDL01受体每天接受0.5 mg睾酮灌胃治疗28天，从大肠杆菌BL21(DE3)/pDL01灌胃后的第二天开始。 使用LC-MS/MS对血清睾酮进行定量，结果显示，补充睾酮后大肠杆菌BL21(DE3)/pDL01受体(289±101 ng/dL)的睾酮水平恢复到对照大鼠的水平(246±134 ng/dL) (图5B)。大肠杆菌BL21(DE3)/pDL01受体(12.44±3.32 ng/g)的脑睾酮水平恢复到对照大鼠的水平(14.03±5.01 ng/g,p=0.989)(图5C）。行为实验结果表明，在接受睾酮的大肠杆菌BL21(DE3)/pDL01受体中，FST和TST中的不动时间以及NSF和飞溅试验中的潜伏时间与对照大鼠相似（图5D和S3G-S3I），这表明补充睾酮可以减轻大肠杆菌BL21（DE3）/pDL01受体的抑郁样行为。接下来，为了验证在实验过程中是否表达3β-HSD，我们在行为分析后使用从粪便样本中获得的蛋白质进行了蛋白质印迹。在来自用睾酮处理的大肠杆菌BL21（DE3）/pDL01受体的样本中观察到条带（图S6I），表明在实验期间大鼠的肠道中表达了3β-HSD。 由于3β-HSD将睾酮转化为AD，在大肠杆菌BL21(DE3)/pDL01受体中至少有3种情况导致抑郁样行为：（1）睾酮缺乏导致抑郁样行为，（2）血清AD水平升高会诱发抑郁样行为，以及(3)睾酮缺乏和血清AD水平升高都会诱发抑郁样行为。先前的一项研究报告了睾酮缺乏与抑郁样行为之间的关系。因此，基于这项研究，我们通过管饲法向ABX治疗大鼠补充AD（0.5 mg/天，共28天），以进一步阐明3β-HSD与抑郁样行为之间的关联。 在行为实验中，AD治疗大鼠的FST和TST中的不动时间以及NSF和飞溅试验中的潜伏时间与对照大鼠相似（图5D和S3G-S3I）。这表明补充AD不会导致大鼠出现抑郁样行为。因此，肠道中3β-HSD的表达可能通过降低大鼠的睾酮水平而导致大鼠出现抑郁样行为。 8 M. neoaurum和3β-HSD在抑郁症患者中普遍存在 为了评估人类肠道中M. neoaurum和3β-HSD的流行率，我们使用qPCR检测了未患抑郁症（n=102）和患有抑郁症（n=107）的参与者粪便DNA中M. neoaurum和3β-HSD的宏基因组流行率。分别使用特异性引物和简并引物扩增M. neoaurum和3β-HSD的基因。对于酶的简并引物，采用BLAST比对MN2019_09885序列，选择所有同源基因设计保守区引物。 结果显示，抑郁组有4.67%(5/107)的患者存在M. neoaurum，而非抑郁组的患者中则没有。此外，42.99%(46/107)的抑郁症患者和16.67%(17/102)的非抑郁症患者存在3β-HSD（图6A）。这些数据表明，M. neoaurum主要存在于抑郁症患者中，3β-HSD在抑郁症患者中的分布比在健康个体中更广泛。此外，3β-HSD的分布比M. neoaurum更广泛，表明M. neoaurum可能不是肠道中唯一表达3β-HSD的细菌。 接下来，为了研究未患抑郁症（n=102）和患有抑郁症（n=107）的参与者中3β-HSD的表达水平，我们使用qRT-PCR来检测粪便RNA。结果显示，3β-HSD在抑郁症组26.17%(28/107)的患者和非抑郁症组4.90%(5/102)的参与者中转录（图6A）。在将这些结果与qPCR数据进行比较后，我们观察到60.87%(28/46)的抑郁症患者在其肠道中显示出3β-HSD的转录，而在非抑郁症患者中这一比例为29.41%(5/17)，这表明抑郁症患者体内的睾酮降解菌在表达3β-HSD方面更为活跃。为探讨3β-HSD与血清睾酮的关系，进行了相关性分析。结果表明，3β-HSD DNA（r=0.257；p=0.001；图6B）和3β-HSD RNA（r=0.266；p<0.001；图6C）的Ct值均与血清睾酮呈正相关，这表明血清睾酮可能受肠道3β-HSD的影响。图6. M. neoaurum和3β-HSD的宏基因组流行率。(A)在非抑郁症个体(n=102)和抑郁症患者(n=107)中检查了M. neoaurum和3β-HSD的宏基因组流行率。Ct值小于38被认为是阳性。(B)3β-HSD DNA的Ct值与血清睾酮(n=184)之间的相关性分析。(C)3β-HSD RNA的Ct值与血清睾酮(n=184)之间的相关性分析。讨论在50多年前就提出了睾酮缺乏会导致抑郁症的想法。然而，相对较少的研究调查了睾酮缺乏的原因。Diczfalusy等人首次发现类固醇激素可以在肠道中转化为其他产品，从而减少类固醇激素在血液中的再吸收。此外，最近的研究表明，肠道微生物可以通过降解途径改变类固醇激素的活性和非活性形式的比例，从而影响一些类固醇激素的水平。然而，肠道微生物在抑郁症发病机制中睾酮代谢中的作用尚未得到研究。在这项研究中，我们发现肠道微生物可以通过降解睾酮降低血清和脑睾酮水平并导致抑郁症状。 本研究的结果为以前未知的机制提供了证据，即肠道微生物群与血清和脑睾酮水平之间的关系。据报道，雌性小鼠灌胃成年雄性盲肠内容物后血清睾酮水平显著升高，这表明肠道微生物可以改变睾酮水平。在这项研究中，可降解睾酮的M. neoaurum降低了血清和大脑的睾酮水平，可能是因为M. neoaurum产生的3β-HSD在重吸收到循环中之前会降解睾酮。M. neoaurumMN2019的存在并不令人惊讶，因为据报道分枝杆菌使用天然甾醇或其他一些甾体化合物作为唯一的能源和碳源。M. neoaurum是一种快速生长的分枝杆菌，可以降解天然类固醇。此外，使用类固醇作为唯一碳源从土壤中分离出M. neoaurum NwIB-01，发现其可将植物甾醇转化为AD、ADD和9α-hydroxy-4-androstene-3,17-dione。值得注意的是，M. neoaurum目前用于制药行业，通过植物甾醇降解产生AD或ADD。由于在肠道中表达3β-HSD的工程大肠杆菌导致大鼠出现抑郁样行为，我们推测在肠道中表达3β-HSD的细菌可能具有降低血清睾酮并导致宿主抑郁的共同特征。这些数据证明了睾酮的肠道微生物群降解在抑郁样行为中的作用，并为理解睾酮缺乏相关的抑郁症提供了遗传基础。AD是一种弱活性形式的睾酮，对雄激素受体的亲和力较低。因此，当睾酮在肠道中被3β-HSD转化为弱活性形式时，血清和大脑中的睾酮水平会降低。这些结果与先前的结果一致，表明肠道微生物群可以通过降解途径改变活性和非活性类固醇水平的比率来影响某些类固醇激素的水平。 本研究确定了一种由肠道中的睾酮降解细菌引起的抑郁症，导致睾酮水平下降和继发于临床性腺功能减退症的抑郁症状。值得注意的是，我们的结果只显示了与低睾酮水平相关的特定抑郁症，而不是所有符合性腺机能减退临床临界值的抑郁症。先前的一篇综述表明，对于继发于临床性腺机能减退的抑郁症状，有强有力的证据表明睾酮替代疗法的有效性；对于没有临床性腺功能减退症的男性的阈下抑郁症状，有初步证据表明增加睾酮的功效；对于没有临床性腺功能减退症的男性的难治性MDD，有强有力的证据表明增加睾酮没有益处。本研究结果表明，补充睾酮可有效减轻大鼠的抑郁样行为，这加强了先前的结论。未来的研究可以比较睾酮补充剂对睾酮降解细菌感染患者与其他表现出继发于临床性腺功能减退症的抑郁症状的患者的影响。确定使用抗生素清除该患者群体中细菌的效果将提供进一步的见解。许多研究表明，与对照组相比，抑郁症患者肠道中的放线菌更为丰富。然而，目前尚不清楚放线菌如何与抑郁症相关联。事实上，放线菌可以代谢类固醇。因此，放线菌家族中的许多细菌可能会降解睾酮。我们推测放线菌可能通过降解睾酮降低血清和大脑中的睾酮水平，从而导致抑郁症。 然而，仍有几个未解决的问题。首先，我们的研究结果表明，抑郁症组中3β-HSD的分布比M. neoaurum更常见，这表明M. neoaurum不是肠道中唯一含有3β-HSD的细菌。本研究未评估其他睾酮降解细菌。其次，在非抑郁组的肠道中也检测到了3β-HSD，说明肠道中3β-HSD是否引起抑郁的调查还应考虑其他因素，如肠道环境中的酶活性、酶表达、酶抑制剂、宿主体内血清睾酮的产生和调节等。酶活性与血清和脑睾酮水平之间的关系有待进一步研究。 睾酮缺乏、肠道微生物代谢和抑郁症发病机制之间关系的发现具有广泛的健康相关意义。本研究揭示了一种机制，该机制可能将含有3β-HSD的肠道微生物降解睾酮与抑郁症风险升高相关联。肠道微生物在这一机制中的作用表明可改变预防睾酮缺乏和/或抑郁症的风险因素。进一步的研究应侧重于随机、双盲对照临床试验，以探索有效的干预措施，如抗生素治疗、睾酮补充剂或3β-HSD抑制剂，以预防睾酮缺乏或抑郁症。 本研究的局限性在这项研究中，所有大鼠在进一步实验之前都被给予短期抗生素以消耗它们的肠道微生物群。然而，在随后4周的喂养中，大鼠的肠道微生物群可能已经慢慢恢复到不同的组成；所以背景肠道菌群（除灌胃菌群外的肠道菌群）可能不同，我们还没有对背景肠道菌群组成进行深入评估。但我们在每批实验中都设置了一个对照组，以排除背景肠道菌群对实验结论的影响。 编译：微科盟听雪斋，编辑：微科盟居居、江舜尧。微科盟原创微文，欢迎转发转载，转载须注明来源《微生态》公众号。